二硫键的形成是氧化还原反应，常用的氧化剂有空气、DMSO、双氧水、I2、汞盐等强弱不等的氧化剂。一般的二硫键构建选用空气、DMSO等弱氧化条件，以免肽链受损。
在生物体内，二硫键的形成是由酶调控完成的，可以精确配对，但在人工合成中会遇到许多问题。在肽链中有两个半胱氨酸残基的情况下，还可能会产生分子间的二硫键甚至多分子聚合的杂质。而当需要配对的巯基个数增多，仅肽链内都可能会产生二硫键错配或不配对的复杂情况，再引入分子间的二硫键配对后，复杂程度立即以指数飙升。
因此，从设计阶段就需要将二硫键的构建纳入考量。
在仅有一对二硫键的情况下，分子内不会产生二硫键错配的情况，需要考虑的是分子间配对和聚合的问题（多个二硫键也有同样问题），稀释无疑是一个很好的解决办法，这对避免或减少其他有关分子间反应的情况同样适用。如果需要稀释的倍数太大，也可以尝试将分子附着或键合在固定相上，利用假稀释效应来解决。
而多对二硫键，可以利用巯基的保护基来解决。其原理是，基于不同的保护基脱除条件，将目标巯基对用同一种保护基保护，完成肽链组装后，逐对脱除巯基保护基并氧化形成二硫键，如此一来，就可以避免二硫键错配的问题。常见的巯基保护基及脱除条件如下表所示：
此外，还有其他一些可通过酶解以及光敏反应的保护基，可根据合成策略进行选择。
在实际的研究过程中，不必拘泥于精确的巯基保护基匹配。在某些多肽的合成中，两对甚至三对二硫键的构建是可以在一步反应中完成的，二硫键的正确率可以高达80%以上，虽然有少许错配的杂质，但可通过纯化等方式除去，总体来说收益要超过精确配对。
我们在研究某多肽化合物三对二硫键的构建中就发现了这个情况，一次性构建三对二硫键的收益远高于通过巯基保护基选择性配对。我们推测，该多肽化合物的线性肽在合适的反应溶剂和离子对体系中，由于线性肽分子各基团对体系的亲/疏性质导致其在溶液中形成自然卷曲，卷曲后的空间构象更接近目标分子的状态，目标巯基在空间上靠近，在氧化过程中自然配对形成正确的二硫键结构。通过HPLC观察反应的变化过程表明，随着时间变化，线性肽总是先转化成某一中间态化合物，然后再转化成产品，这说明在反应过程中，二硫键并不是随机匹配的。HPLC对比图谱如下：
含有多对二硫键的多肽化合物，其二硫键配对是否正确是一个绕不开的话题。在一些已知的多肽中，可以通过一些色谱、光谱以及理化生物活性对其进行测定，甚至可以与标准品和对照品进行比较，可以从侧面说明多肽的空间结构。但在一些含有多个半胱氨酸残基的未知的多肽序列中，如何确定它们的二硫键位置就不能够回避了。
二硫键的定位方法有很多，通过X-射线晶体衍射、多维核磁共振等方法可以不破坏多肽进行分析，但缺陷也很明显，首先要能结晶，其次对样品纯度要求高，最后谱图解析工作量很大。还有需要将多肽序列破坏的分析方法例如对角线法、二硫键异构及突变法、酶解及化学裂解法、部分还原测序法等等。他们都各有特色和其局限性。
本文介绍2002年Jiang Wu和J. Throck Watson改良的化学裂解/肽图法。其核心原理是半胱氨酸残基上的巯基与氰基反应生成硫氰酸酯，再在氨水存在下，肽链从半胱氨酸的N端断裂，生成亚氨基噻唑烷的肽段；另一段将与氨水生成酰胺；需要注意可能会产生β-消除的产物。原理图示如下：
该方法适用性较好，若多肽（或蛋白）中含有游离的巯基，则直接操作上述步骤，最后还原剩余的二硫键，通过质谱分析即可定位游离巯基。若鉴定二硫键，则需要使用弱还原剂将一对二硫键打开（不局限哪一对）还原成巯基，然后再操作上述步骤，继续还原剩余的二硫键，通过质谱分析，与理论值比对即可定位游离巯基。这个过程中，最值得注意的是，还原一对二硫键并不是指向性的，也不能够保证仅还原一对二硫键（甚至还有未还原的），因此，需要将仅还原一对二硫键的产物分离出来，并通过质谱确认。为避免已还原的二硫键在纯化过程中被空气或其他试剂氧化变成二硫键，需要将纯化过程放在氰基化之后而非之前。示意图如下：
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